生態学的時間スケールにわたる相互作用の変化は単一の生物に影響を与える

Jan 26, 2024

ISME Journal volume 17、pages 406–416 (2023)この記事を引用する

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微生物群集は地球上のほぼすべての生息地で繁栄しています。 これらのコミュニティ内では、細胞は代謝産物の放出と取り込みを通じて相互作用します。 これらの相互作用は、コミュニティの個々のメンバーに相乗効果または拮抗効果をもたらす可能性があります。 微生物群集の集団的な代謝活動は、その局所環境の変化につながります。 時間の経過とともに環境が変化するにつれて、細胞間の相互作用の性質も変化する可能性があります。 私たちは現在、このような動的なフィードバックが個々の微生物や微生物群集全体の成長のダイナミクスにどのような影響を与えるのかについての理解が不足しています。 ここでは、環境を介した代謝産物の交換によって媒介される相互作用が、単純な海洋微生物群集内で時間の経過とともにどのように変化するかを研究します。 私たちは、細胞が環境にどのように反応するかということから、細胞が環境に及ぼす影響を解きほぐすことを可能にするマイクロ流体ベースのアプローチを使用しました。 私たちは、キチンの分解者と代謝副産物を消費するクロスフィーダーという 2 つの種の間の相互作用が、細胞が環境を変えるにつれて時間の経過とともに動的に変化することを発見しました。 細胞は最初は積極的に相互作用し、成長の後期段階で競合し始めます。 私たちの結果は、微生物間の相互作用が静的なものではなく、環境の状態に依存することを示しており、環境の変化が種の相互作用にどのような影響を与えるかを解明することの重要性を強調しています。 この実験的アプローチは、自然環境における種間の相互作用が群集レベルのプロセスにどのようにスケールアップするかについて新たな光を当てることができます。

微生物は、地球規模の元素循環、宿主の健康、および多くの産業プロセスに貢献しています。 しかし、私たちは現在、種間の相互作用が個々の群集メンバーの成長をどのように調節するのか、そして個々の群集メンバーの成長がどのようにスケールアップして群集の活動と成長を決定するのかという正確なメカニズムについて定量的な洞察を欠いています[1]。 このような洞察により、微生物群集のレベルで観察される活動が、組織の下位レベルのプロセスからどのように現れるかをよりよく理解できるようになります。

微生物コンソーシアム内の種は集合的に代謝機能を実行します。異化プロセスは多くの場合、環境を介した中間代謝産物の交換を通じて相互作用するさまざまな種に分散されます [2]。 この分散代謝は、分解にいくつかの酵素反応が関与する複雑な基質で特に一般的です [3]。 自然環境において、微生物群集の主な資源はセルロースやキチンなどの天然ポリマーです [4]。 これらのポリマーは多細胞生物の構造成分（植物のセルロース、節足動物のキチン）であり、これらの生物の死により環境中に放出されます。 通常、これらのポリマー上には相互作用する種の複雑なコミュニティが形成されます [5]。 特殊な細菌は、細胞外酵素を介してポリマーを利用可能なサブユニット、つまり細胞に取り込まれるのに十分な大きさの糖モノマーまたはオリゴマーに切断します[6]。 このプロセスは、最終的に天然ポリマーの再石灰化につながる栄養カスケードの基礎を構築します。 ポリマーを分解する能力を持たない一部の細菌細胞は、周囲環境から分解生成物を取り込むことができます [7]。 したがって、これらのいわゆる消費者は、分解者の存在から直接利益を得ます。 ポリマー分解に必要な酵素を欠いている他の微生物種は、さらに、切断された分解生成物を異化することができません。 彼らは成長基質として排泄された代謝副産物に依存しています[8]。 このプロセスはクロスフィードと呼ばれます。

交差摂食、またはシントロフィーは、ある生物が別の生物の副産物を資源として使用する相互作用です[9、10]。 交差摂食は微生物間の多くの相利関係の根底にあり、微生物群集の多様性を維持する原動力となっていると広く考えられている[11、12、13]。 副産物を排泄する種にとっても、交差摂食は有益である可能性がある[14]。 まず、生化学反応の生成物を除去すると、「ル・シャトリエの原理」に従って反応速度が増加します[15]。 第二に、交差摂食により、生産者の成長を阻害する有毒な代謝副産物を除去できる可能性があります[16、17]。

種間の相互作用は一般に、ポジティブ、ネガティブ、またはニュートラルに分類され、通常、共作栽培と単作栽培における収量または成長速度の違いを測定することによって定量化されます[18]。 このアプローチでは、コミュニティ内の相互作用が測定期間中一定のままであると仮定しています。 しかし、細胞は栄養素を消費したり放出したりすることで、環境を動的に変化させます。 次に、個人は環境に引き起こす変化に適応するために代謝行動を変更します[19]。 このプロセスにより、種間の代謝相互作用が時間の経過とともに変化する可能性があります。

細胞は、自身の活動と他のすべてのコミュニティメンバーの活動の両方によって引き起こされる環境の変化に反応します。 これは、環境の状態、コミュニティのメンバーの代謝活動、およびこれらすべてのメンバー間の相互作用が相互依存する複雑なフィードバック ループにつながります [9]。 複雑な生物群集の動態の機構を理解するには、細胞がその環境（つまり、生物群集の他のメンバーが放出する代謝物）にどのように反応するかということと、これらの細胞が環境に及ぼす影響（つまり、代謝物の取り込み）。 しかし、これは伝統的な栽培技術を使用して簡単に行うことはできません。

今回、我々は、群集の集合的な代謝活動によって引き起こされる環境の変化が個々の細胞の成長ダイナミクスにどのような影響を与えるかを分析できる、マイクロ流体工学に基づく新しいアプローチを開発しました。 マイクロ流体工学により、環境に対する細胞の反応を、細胞が環境自体に及ぼす影響から切り離すことができます。 したがって、このアプローチにより、種間の代謝相互作用が時間の経過とともにどのように変化するかを定量化することができます。

私たちはこの方法を、ポリマーキチンを利用した自然由来のコミュニティにおける相互作用を研究するために適用します。 この群集は分解者と共食種であるビブリオ ナトリエゲンスとアルテロモナス マクレオディで構成されています。 Vibrio natriegens は海洋キチン分解者です [20]。 キチンオリゴマーを単量体と二量体に切断して細胞に取り込むために、環境中にキチン分解酵素を分泌します。 Alteromonas macleodii はキチンを分解できません [5]。 さらに、キチン分解生成物を消費する能力がありません。 交差摂食種として、分解者によって生成される排泄された代謝副産物に依存しています。

私たちは、分解者と交差摂食者の間の相互作用が、排泄された代謝副産物をめぐる相利共生から競合へと時間の経過とともに変化することを発見しました。 さらに、デグレーダーとクロスフィーダーの間の最初の積極的な相互作用により、デグレーダーが単独で成長する状況と比較して、コミュニティレベルでの酵素活性の増加が引き起こされます。 最後に、特に栄養濃度が低い期間のクロスフィーダーでは、個々の細胞の増殖速度が大幅に異なる可能性があることを発見しました。

私たちは、微生物群集の集団代謝に応じて動的に変化する環境を経験する単一細胞の成長ダイナミクスを調査できる、マイクロ流体工学に基づく新しいアプローチを開発しました。 これを達成するために、マザーマシンデバイス[21]をコミュニティバッチ培養に結合し、タイムラプス顕微鏡を使用して細胞増殖を追跡します（図1B）。 マイクロ流体デバイスには、分解者である Vibrio natriegens と交差摂食者である Alteromonas macleodii からなる単純なコミュニティの 2 つのメンバーが含まれています (図 1A)。 このデバイスは、血清フラスコ内のフィードバッチ培養に接続されます。 無菌増殖培地と炭素源としてのキチンポリマーを含むこれらの血清フラスコに細菌（デグレーダー単独、またはデグレーダーとクロスフィーダーのいずれか）を低密度で接種します（図1C、D）。 流加培養中の微生物細胞はリソースを消費して増殖するにつれて、遅滞期から指数関数的増殖期、定常増殖期へと移行します。 このプロセスでは、彼らは 2 つの主な関連した方法で環境を順次変化させます。最初に利用できる栄養素はコミュニティのメンバーによって消費され、一方、代謝副産物などの新しい栄養素は、環境への代謝物の放出によって利用可能になります。 代謝産物の取り込みと放出により、バッチ培養内の生化学的環境が常に変化し、その結果、取り付けられたマイクロ流体デバイス内の生化学的環境が変化します。 したがって、マイクロ流体デバイス内の細胞は、バッチ培養内の細胞群と同じ、時間的に変化する代謝環境にさらされますが、下流に位置するため、環境を変更することはできません。 したがって、このアプローチにより、微生物群集内の代謝相互作用が時間の経過とともにどのように変化するかを解き明かすことができます。 以前の研究では、クローン集団における微生物の生理機能に関する基本的な疑問に答えるために、同様のアプローチが使用されてきました[22、23、24、25]。 ここでは、このアプローチを使用して、単純な微生物群集における個々の細胞の成長ダイナミクスを研究します。

キチンが唯一の利用可能な炭素源である状況における、分解者 (V. natriegens、黄色) とクロスフィーダー (A. macleodii、緑色) の間の代謝相互作用の概略図。 B バッチ培養環境での単一細胞の増殖ダイナミクスを定量化するためのマイクロ流体セットアップ。 細菌はマイクロ流体デバイス内で増殖し、微速度撮影顕微鏡を使用して監視されます。 このデバイスは、栄養素と細菌を含むバッチ培養に接続されています。 蠕動ポンプを介して、供給培養液のごく一部がマイクロ流体チップを通して常に洗い流されます。 マイクロ流体デバイス内の単一細胞は、フィードバッチ培養内の細胞と同じ環境にさらされます。 バッチ培養中の細胞は、栄養素の消費と代謝副産物の排出によって環境を変化させます。 マイクロ流体デバイス内の細胞は、成長速度の変化などを通じて環境の変化に応答しますが、環境そのものを変えることはできません。 C、D マイクロ流体チップは、いくつかの独立したメイン チャネルで構成されます。 各チャネルには、コミュニティを構成する 2 つの種のうちの 1 つがロードされ、両方の種を含む完全なコミュニティ (C) または分解者種のみ (D) のいずれかを含む単一のバッチ培養に接続されます。 さまざまなバッチマイクロ流体の組み合わせからの単一細胞の特性を比較することで、群集内の種の存在が他の種や自分自身にどのような影響を与えるかを研究できます。 画像は BioRender から調整され、部分的に Daniel J. Kiviet から提供されました。

私たちはまず、分解者と消費者の両方からなる完全な相互摂食コミュニティによって作り出される代謝環境における成長のダイナミクスを研究しました。 我々はバッチ培養に両方の種を接種し、全サイクル（すなわち、遅れ期から指数関数期を経て定常期まで）にわたって増殖を追跡した。 フィードバッチ培養では、分解者は環境中に溶解酵素を放出し、キチンオリゴマーを消費します。 このプロセス中に、分解者は代謝副産物を環境に放出し、それらは次にクロスフィーダーによって消費されます。 マイクロ流体デバイス内の単一細胞の増殖速度を測定することにより、個々の種の増殖ダイナミクスを分析しました。 クロスフィーダーとデグレーダーは両方とも、バッチ培養物に接種するとほぼ瞬時に増殖を開始します (図 2)。 これは、分解者がキチンの分解を開始するとすぐに、交差摂食のための栄養素が放出されることを示しています。 細胞が成長し、栄養素が枯渇すると、両方の種は定常期に移行し、成長率がゼロに近づきます。 デグレーダーの場合、成長は約 25 時間で止まりますが、クロスフィーダーの場合、成長は 40 時間まで続きます (図 2)。 成長期の期間の違いは、代謝ニッチの違いによって説明できます。 デグレーダーは主にキチン分解産物をもとに増殖しますが[26]、クロスフィーダーはデグレーダーによって排泄される少なくとも1つの代謝副産物を利用することができます[27]。

マイクロ流体デバイス内のデグレーダー (黄色) 細胞とクロスフィーダー (緑色) 細胞を、デグレーダーとクロスフィーダーの共培養を含む成長バッチ培養に接続しました。 バッチ培養では、細胞は 0.1% (w/v) キトペンタオースを含む最少培地で増殖しました。 存在する各細胞の単一細胞増殖速度 (ポイント) を時間の関数としてプロットしました。 線は、一般化された加算モデルを使用して、各時間間隔での平滑化された平均 (geom_smooth、ggplot2、RStudio) を表します。 キチンが分泌酵素によって分解されると、資源が利用可能になり、両方の細胞タイプが増殖し始めます。 クロスフィーダーは、成長率がゼロになるまで、より長い期間成長します。 ４回の反復実験を行った。 合計 5608 個の個々の細胞が分析されました (N(分解者) = 1707; N(クロスフィーダー) = 3901)。 これにより、単一細胞の瞬間増殖率は 270,677 になります (N(分解者) = 140,126; N(クロスフィーダー) = 130,551)。 1363 (N(デグレーダー) = 1086; N(クロスフィーダー) = 274) データ ポイントは軸範囲外のため表示されていません。

成長率が時間の経過とともに非単調に変化することを観察しました (図 2)。 このことから、分解者と交差摂食者の間の代謝相互作用は時間とともに変化するのか、またそれが分解者の成長にどのような影響を与えるのかという疑問が生じます。 この疑問に答えるために、我々は 2 つの異なる環境における分解細胞の単一細胞増殖ダイナミクスを測定しました。 具体的には、分解細胞に 2 つの異なるバッチ培養を与えました。 1 つの培養物には分解者と交差摂食者の共培養が含まれていましたが (図 2)、2 つ目の培養物には分解者が単一培養で含まれていました。

我々は、これら 2 つの条件におけるデグレーダーの成長ダイナミクスが 2 つの主な点で異なることを発見しました (図 3A)。最初は、クロスフィーダーの存在下でデグレーダーの成長速度が高かったです。 クロスフィーダーの存在下では、分解剤は最初の 20 時間で増殖速度が 11% 増加しました。 これは、クロスフィーダーが分解者の代謝相互作用の初期段階での成長を促進することを示しています（図3A、C）。 後期段階では、単一培養における分解細胞は明確な二次増殖期を示します (図 3A)。 この成長段階は共培養環境では欠落しています。 単一培養環境における分解細胞は、共培養環境を経験した個体よりもこの二次増殖期でより高い速度で増殖します。 クロスフィーダーが存在しない場合、分解剤は二次成長段階で約 173% 高い成長速度を示しました。 二次増殖期中の増殖は、40時間の実験終了時にクロスフィーダーのない単一培養環境を経験した分解細胞における全体的なバイオマス蓄積の増加につながります（図3B、D）。 二次増殖期は、以前に排泄された代謝副産物の再取り込みによって説明でき、さまざまな微生物系で観察される二酸化性シフトに対応します[28、29]。

マイクロ流体チップ内の分解細胞は、2 つの異なるバッチ培養に接続されました。1 つは単一培養の分解細胞 (赤色)、もう 1 つは分解細胞とクロスフィーダーの共培養 (黄色) です。 単一細胞の増殖速度 (ポイント) が時間の関数としてプロットされます。 線は、一般化された加算モデルを使用して平滑化された平均 (geom_smooth、ggplot2、RStudio) を表します。 最初の数時間は、共培養培地を供給された分解細胞は、単一培養環境で培養された細胞よりも速く成長します。 後の時点では、共培養で栄養を与えた細胞には存在しない、単一培養で栄養を与えた細胞の顕著な二次増殖期が観察されます。 ４回の反復実験を行った。 全体で 99 のマザーマシン チャネルが分析されました (N(共培養) = 49; N(単培養) = 51)。 合計 3934 個の個々の細胞が分析されました (N(単一培養) = 2227; N(共培養) = 1707)。 1494 (N(単一培養) = 405; N(共培養) = 1089) のデータ ポイントは、軸の範囲外であるため表示されていません。 B 単一培養または共培養環境での分解細胞のバイオマス蓄積。 共培養環境 (黄色) を経験した細胞は、単一培養環境 (赤色) を経験した細胞よりも最初の 20 時間でより高い収量まで増殖する傾向があります。 二次増殖期の利点により、単一培養の細胞は実験終了時により高い全体収量に達するようです。 C 2 つの主要な増殖期間の分解細胞の平均増殖速度の比較。 単一細胞の増殖速度は各時点で平均され（図S2）、2つの20時間の時間枠に分けられました。 最初の 20 時間の間、分解者が共培養環境 (赤色) を経験した場合、単一培養条件と比較して、単一細胞の増殖速度が大幅に高くなりました。 混合効果モデル (実験の固定効果培養タイプとランダム効果日) を使用した分析により、共培養条件の方が有意に高い増殖速度が明らかになりました。 (N(共培養) = 956; N(単培養) = 956、増殖率の差 = 0.09、標準誤差 = 0.02、p « 0.001)。 この段階での増殖率は、共培養条件の方が 11.1% (±2.6%、標準誤差 SE) 高かった。 第二次増殖期の増殖は単一培養の方が大幅に高くなります。 (N(共培養) = 956; N(単培養) = 956、増殖率の差 = 0.52、標準誤差 = 0.02、p « 0.001)。 この段階での増殖率は、単一培養条件の方が 173.3% (±7.4%、SE) 高かった。 D 2 つの時点での両方のバッチ培養条件での総細胞増殖の比較。 各マイクロ流体マザーマシンのバイオマス蓄積を計算しました (方法を参照)。 一次増殖期の間、分解細胞はバイオマス蓄積に統計的な差異を示さなかった。 混合効果モデル（実験の固定効果培養タイプとランダム効果日）を使用した分析では、20 時間後の共培養と単一培養の間のバイオマス蓄積に統計的に有意な差がないことが明らかになりました（N(共培養) = 49; N(単一培養) = 51、バイオマスの差 = 0.06、標準誤差 = 0.03、p = 0.06)。 分解者は、単一培養条件で最初の 20 時間で 1.1% (±1.1%、SE) 多くのバイオマスを蓄積しました。 混合効果モデル（実験の固定効果培養タイプとランダム効果日）を使用した 40 時間の分析により、単一培養と共培養の間のバイオマス蓄積における統計的に有意な差が明らかになりました。 (N(共培養) = 49; N(単培養) = 51、バイオマスの差 = 0.22、標準誤差 = 0.04、p « 0.001)。 分解者は、単一培養条件での 40 時間の実験の終了時点で 26.2% (±4.6%、SE) 多くのバイオマスを蓄積しました。

私たちのデータは、生態学的時間スケールにおける分解者と交差摂食者の間の相互作用の変化を明らかにしています。成長期間の経過とともに、分解者に対する交差摂食者の影響はプラスからマイナスに変わります。 最初に、クロスフィーダーは、おそらく成長阻害物質の除去または成長促進代謝産物の生成を通じて成長を促進し、それが分解者の成長にプラスの影響を与えます。 後の段階では、クロスフィーダーの存在により分解者の増殖が減少します。これはおそらく 2 種類の生物が代謝副産物をめぐって競合するためと考えられます。 私たちのデータは、分解細胞がポリマー上での増殖中（第一増殖期）に代謝副産物を培地に放出することを示唆しており、この解釈は以下で私たちがテストして支持しています。 これらの副産物の一部は分解者とクロスフィーダーの両方によって消費される可能性がありますが、クロスフィーダーは放出された副産物を絶えず消費するため、クロスフィーダーが存在する場合、分解者細胞は第 2 の増殖期を示さなくなります。 。 これらの結果は、コミュニティのメンバー間の相互作用が生態学的に短い時間スケールで変化する可能性があることを示しています。

分解者は単一培養では第 2 成長期を示すことができるが、クロスフィーダーとの共培養では示せないという我々の発見は、どの代謝物が主に分解者と分解者との間の代謝相互作用を推進しているのかという疑問を提起します。クロスフィーダー。 海洋微生物群集における一般的な相互作用メカニズムは、酢酸塩の生成と消費です [30]。 酢酸塩の生成と消費が、私たちのシステムにおける分解者とクロスフィーダーの間の相互作用に役割を果たしているかどうかをテストするために、単一培養物と共培養物の酢酸塩濃度を経時的に測定しました。 まず、異なる時点での単一培養と共培養の間で酢酸塩レベルが異なるかどうかを調査しました。 我々は、実験の最初に培地中の絶対酢酸レベルが増加することを発見しました（図4A）。 これは、酢酸塩の生成が最初のキチン分解の代謝副産物であることを示しています。 酢酸塩レベルは、2 つのバッチ培養条件で時間の経過とともに変化します。 共培養では、酢酸濃度はより低いピークレベルに達し、集団サイズで補正すると全体的に低くなります（図 4B）。 これらの発見は、クロスフィーダーが生成されたアセテートの一部を常に消費していることを示しています。 分解者の単一培養では、酢酸は初期段階で蓄積し、後の時点で減少します。 これは、機会があれば、分解者が以前に放出された酢酸塩を消費し、二次増殖につながることを示しています。 次に、両方の細胞タイプが蓄積された酢酸塩を利用できるかどうかを検証したいと考えました。 我々は、コミュニティの両方のメンバーが、単一培養バッチまたは共培養バッチの使用済み培地で増殖している場合、酢酸塩を消費することを発見しました（図4C）。 まとめると、我々の結果は、キチン分解の初期段階で代謝副産物として酢酸が生成されることを示しています。 単一培養では、分解者はキチンがまだ利用可能な実験の初期段階で酢酸塩を生成し、一次資源が枯渇すると酢酸塩を消費します（図S4）。 共培養では、クロスフィーダーは酢酸塩の一部を常に消費します。 これにより、共培養条件における分解物の二次増殖段階が妨げられます。 私たちのデータは、分解者によって放出される酢酸塩がクロスフィーダーの重要な栄養源であることを示しています。 しかし、追加の代謝物も交差摂食相互作用に関与している可能性があり、代謝相互作用の全範囲を明らかにするにはさらなる研究が必要です。 酢酸塩は代謝による交差摂食に関与する一般的な代謝産物ですが、分解者によって放出される可能性のある大量の代謝産物は、私たちの研究では特徴付けられていません。 したがって、このシステムにおける正確な代謝相互作用は不明であることに注意することが重要です。

バッチ培養でさまざまな時点で測定された酢酸濃度。 A バッチ培養における分解物の単一培養 (赤色) および共培養 (黄色) の酢酸レベルは、時間の経過とともに変化します。 クロスフィーダーの存在により、全体的なアセテートレベルが低下します。 (ウェルチ 2 サンプル t 検定; N = 8; 12 時間: 単一培養の平均 = 1.29 FU、共培養の平均 1.09 FU; t = 1.50、p 値 = 0.09、24 時間: 単一培養の平均 = 2.95 FU、共培養の平均 1.93 FU; t = 2.17、p 値 = 0.02、36 時間: 単一培養の平均 = 2.95 FU、共培養の平均 2.28 FU; t = 2.23、p 値 = 0.02、48 h: 単一培養の平均 = 2.31 FU、共培養の平均 2.00 FU; t = 1.27、p 値 = 0.11)。 B バッチ培養における分解物の単一培養 (赤色) および共培養 (黄色) の OD あたりの酢酸レベルは時間の経過とともに変化します。 初期段階では、OD あたりの相対的な酢酸濃度が高くなります。 (ウェルチ 2 サンプル t 検定; N = 8; 12 時間: 単一培養の平均 = 9.39 FU、共培養の平均 6.94 FU; t = 2.14、p 値 = 0.03、24 時間: 単一培養の平均 = 7.43 FU、共培養の平均 4.11 FU; t = 4.22、p 値 « 1e−3、36 時間: 単一培養の平均 = 4.96 FU、共培養の平均 2.15 FU; t = 3.42、p 値 = 0.005 、48 時間: 単一培養の平均 = 2.58 FU、共培養の平均 1.61 FU; t = 2.38、p 値 = 0.02)。 C 分解細胞およびクロスフィーダー細胞は、利用可能な酢酸塩を消費する可能性があります。 デグレーダーとクロスフィーダーがバッチ培養からの使用済み培地で増殖する場合、増殖前 (赤色) と 48 時間の増殖後 (緑色) の酢酸レベルは変化します。 (ウェルチ 2 サンプル t 検定; N = 4; 単一培養のクロスフィーダー: 開始時の酢酸塩の平均 = 2.79 FU、終了時の酢酸塩の平均 0.91 FU; t = 5.69、p 値 = 0.005; クロスフィーダーオン共培養: 開始時の酢酸塩の平均 = 2.22 FU、終了時の酢酸塩の平均 0.89 FU; t = 6.50、p 値 = 0.004; 単一培養の分解剤: 開始時の酢酸塩の平均 = 3.11 FU、終了時の酢酸塩の平均2.15 FU; t = 2.61、p 値 = 0.02; 共培養の分解者: 開始時の酢酸塩の平均 = 2.35 FU、終了時の酢酸塩の平均 0.89 FU; t = 5.12、p 値 = 0.007)。

栄養素の利用可能性をポリマー分解に依存する微生物システムでは、増殖と酵素生成は密接に結びついています。酵素生成と活性の増加により、同化可能な分解生成物の濃度が増加し、したがって増殖の可能性が高まります。 分解者の増殖速度は最初はクロスフィーダーの存在下で増加するため（図3）、クロスフィーダーが分解者の総酵素活性を（生産量の増加を通じて、または生産量の増加によって）増加させるかどうかを調査しました。酵素分子あたりの触媒活性）。 この目的を達成するために、分解者が単独で増殖しているときと、クロスフィーダーの存在下で増殖しているときの総酵素活性を測定しました。 市販の酵素アッセイキットを使用して、無細胞上清中のキチナーゼの比活性を測定しました。 共培養では、分解物の単一培養と比較してキチナーゼ活性が増加することがわかりました（図5）。 クロスフィーダーには、ポリマーキチンを切断する酵素がありません（図S1）。 代わりに、我々のデータは、クロスフィーダーの存在が分解細胞内の総酵素活性を増加させたことを示しています。 コミュニティの合計 OD を使用して酵素活性を正規化しました。 コミュニティの一部はクロスフィーダー細胞で構成されているため、分解者バイオマス単位あたりのキチナーゼ活性は過小評価されます。

0.1% キトペンタオース (w/v) を含む最少培地における指数関数的増殖期における単位 OD (光学密度) あたりのキチナーゼ活性。 クロスフィーダーの存在は、群集の全体的なキチナーゼ活性を大幅に増加させます。混合効果モデル（固定効果培養タイプと実験のランダム効果日を使用）では、共培養条件で有意なキチナーゼ活性が明らかになりました。 N(共培養) = 8; N(単培養) = 8、キチナーゼ活性の差 = 1.0、標準誤差 = 0.36、p = 0.005)。 キチナーゼ活性は、共培養条件で 241.2% (±85.7%、SE) 高くなりました。

より高い酵素活性は 2 つの方法で発生します。 この効果は、酵素自体の触媒活性を低下させる代謝産物の除去（つまり、クロスフィーディングによる）の結果であると考えられます。 あるいは、分解者による酵素生成の増加などの他の効果も考えられます。 したがって、我々のデータは、クロスフィーダーが分解者の酵素活性を高めることによってキチン分解のコミュニティレベルの機能に影響を与えることができることを示唆しています。 溶解酵素の活性が増加すると、一般にキチン分解産物の利用可能性が増加し、したがって分解物の増殖速度が速くなります。 今後の研究では、この現象の正確なメカニズムに取り組む予定です。

我々は、クロスフィーダーが分解細胞の増殖とキチナーゼ活性を増加させることを観察しました。 これは、交差摂食者が分解者の成長促進とその結果としての代謝副産物の増加を通じて、この相互作用から間接的な利益を受けているのかどうかという疑問を引き起こします。 今回我々は、2 つの異なるフィードバッチ培養から栄養素を供給されたクロスフィーダー細胞の単一細胞増殖ダイナミクスを測定することで、この疑問に取り組みます。 1 つの培養にはデグレーダーとクロスフィーダーの共培養が含まれていましたが (図 2)、2 つ目の培養にはデグレーダーが単一培養で含まれていました。

共培養では、クロスフィーダーは、酵素活性を刺激するなどして、分解者と相互作用できる自然群集内と同様に動作します。 単一文化に接続すると、クロスフィーダーは純粋に分解者によって形成された環境を経験します。 マイクロ流体デバイス内の個々のクロスフィーダー細胞は、フィードバッチ培養内の分解者集団の代謝プロセスに影響を与えることなく反応します。 このシステムの自然な同等物は、クロスフィーダーが非常にまれであるため、その存在によって分解者の行動が変化せず、排泄された代謝副産物を摂取できるコミュニティです。 このアプローチを使用して、クロスフィーダーが分解者と相互作用し、その存在を通じて環境に影響を与えることができるときに、クロスフィーダーがより良く成長するかどうかを定量化します。

最初の20時間の間、クロスフィーダーが分解者の成長ダイナミクスに及ぼすプラスの効果は、成長速度の増加（図6A、C）やそれ自体のバイオマス生産（図6B、D）には反映されていないことがわかりました。 この間、クロスフィーダーをデグレーダー単培養バッチに接続すると、単一細胞の増殖速度が約 7% 増加しました。 これは、クロスフィーダー細胞が排泄された代謝産物を絶えず消費するため、成長に必要な栄養素が制限されていることを示している可能性があります。 後の時点では、分解物の単一培養条件を経験するクロスフィーダー細胞の高い単一細胞増殖率とバイオマス蓄積が観察されます（図6A〜D）。 この期間中、クロスフィーダーはフィード培養の一部ではなかった場合、単一細胞の増殖速度が 211% 増加しました。 単一培養と共培養の間の成長ダイナミクスのこの違いは、種内競争によって説明できます。 クロスフィーダーがコミュニティの一部である場合、フィーディング培養中のクロスフィーダー細胞は代謝産物を消費するため、マイクロ流体デバイス内のクロスフィーダーによるこれらの代謝産物へのアクセスが減少します。 これは、共培養環境では、交雑摂食動物が種内競争を経験することを意味します。 この競争は、分解物の単一培養環境では存在しません。 したがって、総合すると、我々のデータは、群集における相互摂食者の存在が代謝副産物の急速な枯渇につながり、したがって種内競争の増加につながることを示唆しています。

マイクロ流体チップ内のクロスフィーダー細胞は、2 つの異なるバッチ培養に接続されました。1 つは単一培養のデグレーダー細胞 (赤)、もう 1 つはデグレーダーとクロスフィーダーの共培養 (緑) です。 単一細胞の増殖速度 (ポイント) が時間の関数としてプロットされます。 線は、一般化された加算モデルを使用して平滑化された平均を表します。 当初、クロスフィーダー細胞は両方の環境で同等の増殖軌跡を示しました。 共培養中のクロスフィーダー細胞は分解者によって排泄された代謝物を消費するため、利用可能なリソースを使い果たし、マイクロ流体デバイス内の細胞の増殖速度は最終的に低下します。 分解物の単一培養環境では、以前に放出された代謝副産物をすべて消費する細胞は存在しません。 この条件下では、マイクロ流体デバイス内の細胞は栄養素をめぐる競合を経験しないため、継続的に成長することができます。 ４回の反復実験を行った。 全体で 100 のマザーマシン チャネルが分析されました (N(共培養) = 60、N(単培養) = 40)。 合計 6558 個の個々の細胞が分析されました (N(単一培養) = 2657; N(共培養) = 3901)。 322 (N(単一培養) = 48; N(共培養) = 274) のデータ ポイントは、軸の範囲外であるため表示されていません。 B 単一培養または共培養環境を経験した場合のクロスフィーダー細胞のバイオマス蓄積。 最初の 20 時間では、2 つの条件の細胞は同じ速度でバイオマスを蓄積します。 共培養環境を経験しているクロスフィーダー細胞の場合、バイオマスは 20 時間の時点で頭打ちになり始めます。 分解者の単一培養バッチに接続された単一細胞は、実験が終了するまで一定の速度でバイオマスを蓄積します。 C 2 つの主要な増殖期間のクロスフィーダー細胞の平均増殖速度の比較。 単一細胞の増殖速度を 2 つの 20 時間の時間枠に分けました。 最初の 20 時間の間、単一細胞の増殖速度は、クロスフィーダーが分解物の単一培養環境を経験した場合、共培養環境を経験した細胞と比較して著しく高かった。 混合効果モデル（実験の固定効果培養タイプとランダム効果日を使用）を使用した分析により、単一培養条件の方が有意に高い増殖速度が明らかになりました。 (N(共培養) = 956; N(単培養) = 956、増殖率の差 = 0.04、標準誤差 = 0.01、p « 0.001)。 この段階での増殖率は、単一培養条件の方が 6.8% (±1.2%、SE) 高かった。 後の段階では、二次増殖期の増殖は、分解酵素単培養に接続された細胞の方が有意に高くなります（混合効果モデル（固定効果培養タイプと実験のランダム効果日）では、分解酵素の増殖速度が有意に高いことが明らかになりました） -培養条件; N(共培養) = 956; N(単一培養) = 956、増殖率の差 = 0.64、標準誤差 = 0.01、p << 0.001)。 この段階での増殖率は、単一培養条件の方が 210.5% (±4.1%、SE) 高かった。 D 2 つの時間間隔における両方のバッチ培養条件での総細胞増殖の比較。 各マイクロ流体マザーマシンのバイオマス蓄積を計算しました (方法を参照)。 混合効果モデル (実験の固定効果培養タイプとランダム効果日) を使用した分析により、20 時間後の共培養と単一培養の間のバイオマス蓄積における統計的に有意な差が明らかになりました (N(共培養) = 60; N(単培養) = 40、バイオマス差 = 0.14、標準誤差 = 0.06、p = 0.01)。 クロスフィーダーは、単一培養条件で最初の 20 時間で 7.5% (±3.0%、SE) 多くのバイオマスを蓄積しました。 後の段階では、単一培養環境を経験した細胞はより多くのバイオマスを蓄積します。 混合効果モデル (実験の固定効果培養タイプとランダム効果日) を使用した分析により、20 時間後の共培養と単一培養の間のバイオマス蓄積における統計的に有意な差が明らかになりました (N(共培養) = 60; N(単一培養) = 40、バイオマス差 = 1.58、標準誤差 = 0.12、p « 0.01)。 クロスフィーダーは、単一培養条件で 59.7% (±4.5%、SE) 多くのバイオマスを蓄積しました。

以前の研究では、細胞増殖速度が集団内の個々の細胞間で大きく異なる可能性があることが示されています[31]。 この成長速度の変動は、細胞の微小環境の変動 [32] または確率的変動 [33] のいずれかによって引き起こされる可能性があります。 私たちのマイクロ流体アプローチの利点の 1 つは、細胞増殖速度の変動を直接測定し、それが種間の相互作用に依存するかどうか、またどのように依存するかを評価できることです。

私たちは、細胞増殖速度の変動と細胞増殖速度の分布が種間の相互作用に依存するかどうかを調査しました。 一般に、デグレーダーの分布はクロスフィーダーよりも狭いことがわかりました (図 7)。 分解細胞の増殖速度分布は増殖条件間であまり変化しませんが、時間の経過とともに変化します（図S5およびS6）。 対照的に、クロスフィーダーでは、後の時点で単一培養条件と共培養条件の間で増殖速度分布の形状に大きな変化が観察されました（図S5）：単一培養条件では、後の時点での増殖速度成長が速い部分集団と成長が遅い部分集団が 1 つある二峰性分布 (図 7) を示しています。 これは、交差摂食者がまれである場合（単一栽培環境で模倣される場合）、個体群の一部が成長期の後半に高い成長率を達成できることを示しています。 おそらく、依然としてかなりの濃度で発生する代謝副産物によるものと考えられます。 人口の 2 番目の部分は増加しないか、増加がかなり遅いようです。 共培養条件では、この急速に成長する部分集団は存在せず、全体の細胞成長率はより狭い分布に従います。 成長サイクル後半における遺伝的に同一の細胞間の成長速度における表現型の不均一性の出現は、栄養素の制限がどのようにクローン集団の成長の違いを促進するかについての以前の観察と一致しています[32]。

単一細胞の増殖速度の変動は、条件が異なると分解者と交配者で異なります。 A 34 ～ 36 時間の共培養 (黄色) および単一培養 (暗赤色) での分解者の単一細胞増殖速度の密度分布。 単一培養の分解剤: cv = 1.50、var = 0.004、共培養の分解剤 cv = 4.24 var = 0.003。 二峰性の計算では、どちらの条件でも二峰性の成長は見られません。 (Hartigan のディップ統計、共培養: D = 0.003、p = 0.99、単一培養: D = 0.003、p = 0.99)。 B 34 ～ 36 時間の共培養 (緑色) および単一培養 (薄赤色) でのクロスフィーダーの単一細胞増殖速度の密度分布。 変動係数 (cv) と分布の分散 (var) は、これら 2 つの条件間の明確な違いを示しています。 単一培養でのクロスフィーダー: cv = 0.61 var = 0.018、共培養でのクロスフィーダー CV = 1.37 var = 0.005。 Hartigan のディップ テストを使用した二峰性の計算では、分解物の単一培養で増殖した場合 (D = 0.02、p < 0.001)、クロスフィーダーの明確な二峰性分布が示されましたが、共培養での増殖ではそうではありませんでした (D = 0.004、p = 0.75)。 。

群集の状況における細胞の定量的な単一細胞測定により、通常は実験的に取り組むのが難しい微生物システムの生態学における基本的な質問をすることができます。 (1) ある種の成長ダイナミクスは、別の種の存在によってどのような影響を受けますか? (2) 微生物群集における種間の相互作用は時間の経過とともにどのように変化しますか? (3) 種は他の種に与える影響から利益を得ていますか?

我々は、相互作用が生態学的時間の経過とともに変化することを示した。初期段階では、クロスフィーダーは、個々の酵素の触媒活性を高めるか、キチナーゼ発現の増加を誘導することによって、分解者の増殖を増加させるが、後期には、他のものと競合することによって、分解者の増殖を減少させる。酢酸などの代謝副産物に使用されます。 したがって、全体として、交差摂食者は分解者の成長に悪影響を及ぼしました。 さらに、クロスフィーダーの成長は主に資源をめぐる種内競争の影響を受けることを示しました。

自然の生態系では、代謝相互作用が遍在しています。 多くの場合、細胞がセルロースやキチンなどの天然ポリマーに定着して分解し、細胞内に取り込まれるサブユニットに消化するために細胞外酵素が利用されるときに、これらの現象が観察されます[6]。 これらの環境では、非溶解性種がポリマー分解者によって排泄される代謝副産物を共食します。 これらのポリマー粒子に定着する微生物群集は、連続的な動態に従います [5]。 さまざまな代謝能力を持つ多様な微生物が、さまざまな時点で海洋粒子に定着します。 私たちはこのような自然系で起こる相互摂食を小さな群落を用いて研究しました。 私たちは、長期的な継承パターンに加えて、短期間スケールで変化する相互作用がこれらのコンソーシアムのコミュニティレベルの特性に影響を与えることを観察しました。 将来的には、私たちのシステムをより複雑なコミュニティに簡単に拡張できる可能性があります。 たとえば、焦点種が群集動態に及ぼす影響を、この焦点種を含むバッチ培養と含まないバッチ培養を使用して研究し、マイクロ流体デバイス (チャネルごとに 1 種) を使用してすべての群落メンバーの成長を定量化できます。 マイクロ流体工学では比較的簡単な並列化が可能であり、最大 6 ～ 8 人のメンバーからなるコミュニティは現在のツールを使用して調査できる可能性があります。 さらに、2 つの細胞型の初期部分に対する群集動態の依存性を調査することは興味深いでしょう。

私たちの発見は、自然環境における微生物相互作用の主な性質について重要な疑問を提起します。 自然界では、ポリマーを分解する微生物群集は化学物理的要因の影響を受けます。 海洋生態系における拡散または局所的な流れは、排泄された代謝副産物の蓄積を防ぐ可能性があります。 これにより、以前に放出された代謝産物を消費する分解者の能力が低下します。 したがって、デグレーダーとクロスフィーダーの間の相互作用は、ポジティブな促進とシントロピーに向けてより導かれる可能性があります。

これらの結果は、種間相互作用一般、特にその時間的動態の寄与を生態系スケールモデルに組み込むことの重要性を浮き彫りにしている。 最終的に、これらの発見は、私たちと私たちの生態系の幸福に関連する微生物群集を設計するのに役立つかもしれません。

野生型株Vibrio natriegens ATCC 14048およびAlteromonas macleodii spを使用しました。 4B03 (非凝集型) は海洋粒子から分離されました [8]。 株をマリンブロス（MB、Difco 2216）中で培養し、25℃で一晩増殖させた。 合計 1 ml の細胞培養物を 1.5 ml 微量遠心管中で遠心分離しました (13,000 rpm で 2 分間)。 上清を捨てた後、炭素源を含まないMBL最少培地1mlで細胞を洗浄した。 細胞を再度遠心分離し、細胞ペレットを 0.002 OD600 に調整した 1 ml の MBL (海洋最少培地) [30, 34] に再懸濁しました。 これらの培養物からの細胞を、0.1％（重量/体積）のペンタアセチル-キトペンタオース（Megazyme、アイルランド）を含むMBL最少培地中で実験に使用した。 炭素源をMBL最小培地に添加し、0.22μmの界面活性剤を含まない酢酸セルロースフィルター(Corning, USA)を使用してフィルター滅菌した。 合計500μlの調製した培養物(250μl+共培養用250μl)を、血清フラスコ中の9.5mlのMBL+0.1%キトペンタオース(v/w)に添加した。 これにより、開始ＯＤは０．０００１となった。 フラスコにはスターラーが含まれており、ゴムシールで密閉されました。 血清フラスコをベンチトップマグネティックスターラー（５００ｒｐｍ）上に保管し、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＮＤＬ ＮＯ ＨＵＢ針（ｇａ２１／１３５ｍｍ／ｐｓｔ２）を介してマイクロフルイディクスセットアップに接続した。

マイクロ流体実験は、以前に記載されているように実行されました[35、36、37、38]。 細胞増殖は、25 × 1.4 × 1.26 μm (長さ × 幅 × 高さ) のマザーマシン チャネル内で画像化されました。 これらのチャネル内で、細胞は主要なフロー チャネルを通じて拡散するバッチ培養培地を経験する可能性があります。 マイクロ流体デバイスは、PDMS フローセル (50 μm/23 μm) で構成されていました。 PDMS フローセルは、SYLGARD 184 シリコーン エラストマー キットの化学薬品を 10:1 (w/v) で混合し、その混合物をマスター ウェイバーに注ぎ、80 °C で 1 時間硬化させることによって製造されました。 固体 PDMS フローセルをマスターウェーブから切り出し、PDC に「高」設定を 30 秒間適用することにより、カバーガラス (Ø 50 mm) に結合する前に、各フローチャネルの両端に穴を開けました。 Harrick Plasma の 32G プラズマ クリーナー。 フローセルは、40 mm Adtech PTFE チューブ (内径 0.3 mm × OD 0.76 mm) を介して、40 mm の Ismatech チューブ (ID 0.25 mm、OD 0.90 mm) を備えた Ismatech 10 K ポンプに接続され、これも 80 mm Adtech PTFE を介して接続されました。 5 mm 短い Cole-Parmer Tygon マイクロボア チューブ (EW-06418-03) (ID 0.762 mm OD 2.286 mm) コネクタ チューブを介して、Hamilton NDL NO HUB 針 (ga21/135 mm) にチューブ (内径 0.3 mm × OD 0.76 mm) /pst 2) フィード培養に挿入されました。 実験全体を通じて、ポンプ流量は 1.67 μl/min (0.1 ml/h) に設定されました。

顕微鏡イメージングは​​、×100 NA1.3 油浸位相差対物レンズ、ORCA-flash 4.0 v2 sCMOS カメラ (浜松市)、および自動ステージ コントローラー (Marzhauser Wetzlar、ドイツ)、シャッター、レーザーベースのオートフォーカス システム (Olympus ZDC 1 および 2)。 顕微鏡のセットアップに関する詳細情報は、D'Souza et al. によって説明されています。 [39]。 同じ PDMS チップ上のチャネルを並行して撮像し、各位置の位相コントラスト画像を 5 分ごとに取得しました。 顕微鏡ユニットと PDMS チップは室温に維持されました。 すべての実験は 0.1 ml h-1 の流量で実行され、これにより栄養素が拡散を通じてチャンバーに確実に流入します。 4 つの生物学的複製を実行しました。 これらの複製は、4 つの独立したマイクロ流体チャネル (各株に 2 つ) で構成されます。 これらのチャネルは、2 つの独立したバッチ培養の 1 つに接続されました。

顕微鏡データセットは 200 のマザー マシン チャネルで構成されます。 共培養のデグレーダー用に 49 チャンネル、単一培養のデグレーダー用に 51 チャンネル、単一培養のクロスフィーダー用に 40 チャンネル、共培養のクロスフィーダー用に 60 チャンネル。

画像処理は、Vanellus 画像解析ソフトウェア (Daan Kiviet、https://github.com/daankiviet/vanellus) の修正バージョンと、Ilastik [40] およびカスタム作成された Matlab スクリプトを使用して実行されました。

ムービーはステージの動きを補正するために登録され、成長チャンネルの領域にトリミングされました。 続いて、Ilastik の教師付きピクセル分類ワークフローを使用して位相コントラスト画像上でセグメンテーションが実行され、Vanellus ビルトイン追跡アルゴリズムを使用して細胞追跡が実行されました。

各マザーマシンのセグメンテーションと追跡を視覚的にキュレーションした後、フレームごとに、カスタムで作成された matlab スクリプトを使用して成長パラメーターが計算されました [36]。 個々のセルの長さは、セル マスクに 3 次多項式を当てはめてセルの中心線を見つけることによって推定されました。 次に、セルの長さは、自動的に検出されたセル極の位置間の中心線の長さとして計算されました (詳細については、Kiviet et al. [33] を参照)。

測定された細胞長の軌跡から単一細胞の伸長率 r を計算することで細胞の成長を定量化しました: L(t) = L(0)∙e^(r ∙ t)。 細胞の長さと増殖速度は、実験の時間の経過とともに大幅に変化しました。 したがって、我々は、成長の速い大きな細胞と成長していない小さな細胞の両方の伸長率を確実に推定できる堅牢な手順を開発しました。 まず細胞の長さを対数変換し、その後、長さ 5 時間 (60 時点) の移動時間ウィンドウにわたって平滑化しました。 伸び率の変化に対する感度を維持しながらノイズを最小限に抑えるために、重み付き線形最小二乗法 (Matlab 平滑関数の rloess 法) を使用した 2 次局所回帰を使用しました。 続いて、瞬間的な伸び率を、30 分の移動時間枠 (7 つの時点) にわたる線形回帰の傾きとして推定しました。 適合品質が悪かった時点 (χ2 > 10−4) は分析から除外されました [32]。 すべてのパラメーターは、すべての反復からランダムに選択された多くの細胞長の軌跡のフィッティング手順を視覚的に検査することにより、手動で最適化されました。

マザーマシンのチャネルからセルが継続的に失われるため、チップ内で生成されるバイオマスの総量を計算することは簡単ではありません。 したがって、観察された単一細胞の伸長速度からこの量を推定する必要があります。 具体的には、特定の時点までに個々のマザーマシンごとに生成されるバイオマスの総量を次のように推定しました。

ここで、 は時点 i における特定の複製内のすべての細胞の平均増殖率であり、Δt は 2 つの時点間の時間間隔です。 平均増殖速度を使用することで、細胞間の増殖速度の変動を無視します。 ただし、増殖率が時間とともに細胞間でも変化する場合、集団の増殖を計算することは困難ですが、現在の方法でも細胞増殖に対する相互作用の全体的な影響を捉えることができます。

すべてのマイクロ流体実験は 4 回繰り返されました。 視覚的キュレーション後の分析から除外された細胞はありませんでした。 V. natriegens については、2227 細胞を単一培養で分析し、1707 細胞を共培養で分析しました。 A. macleodii については、2657 細胞は単一培養で分析され、3901 細胞は共培養で分析されました。 各マザーマシンのチャンネルは独立したサンプルとして扱われました。 すべての統計分析は Rstudio v1.2.5033 で実行されました。 増加率は、対応する値間の推定値の相対差を使用して計算されました。 混合効果モデル分析には、次の方程式を持つ LmerTest パッケージ (バージョン 3.1-3) [41] が使用されました: y ~ Batch + (1 | Replicate) Tukey Post hoc テストは、Multcomp パッケージ (バージョン 1.4-15) を使用して実行されました。 [42]。

デグレーダー細胞とクロスフィーダー細胞をマリンブロス (MB、Difco 2216) で培養し、25 °C で一晩増殖させました。 合計 1 ml の細胞培養物を 1.5 ml 微量遠心管中で遠心分離しました (13,000 rpm で 2 分間)。 上清を捨てた後、細胞を炭素源を含まないMBL最少培地1mlで洗浄した。 細胞を再度遠心分離し、細胞ペレットを0.002 OD600に調整した1 mlのMBLに再懸濁した。 合計 10 μl の細胞培養物を、0.1% キトペンタオース (w/v) を含む 190 μl の MBL に添加しました。 培養物をプレートリーダー (Eon、BioTek) 内で 25 °C で対数増殖期まで増殖させました。 マルチウェルフィルタープレート (AcroPrep) を使用して培養物を滅菌濾過し、新しい 96 ウェルプレートに移すことによって、無細胞上清を生成しました。 無細胞上清のキチナーゼ活性を、プロトコールに従って市販の蛍光キチナーゼアッセイキット（CS1030、Sigma-Aldrich）を使用して測定した。 つまり、10 μl の滅菌上清を 90 μl のアッセイミックスに加えました。 この溶液を暗所で25℃で40分間インキュベートした後、プレートリーダー（Synergy MX、Biotek）で蛍光（励起360 nm、発光450 nm）を測定しました。 OD600 あたりの対数キチナーゼ活性を 8 回の反復で分析しました。

標準濃度を使用して、ml あたりの単位でのキチナーゼ活性を計算しました。 次の式を使用します: \({{{{{\rm{Units}}}}}}/{{{{{\rm{ml}}}}}} = \frac{{\left( {{{{ {{\rm{FLU}}}}}} - {{{{{\rm{FLUblank}}}}}}} \right) \times 1.9 \times 0.3 \times {{{{{\rm{DF} }}}}}}}{{{{{{{\rm{FLUstandard}}}}}} \times {{{{{\rm{time}}}}}} \times {{{{{\rm {ヴェンツ}}}}}}}\)

ここで、FLU は測定された蛍光を示し、DF は希釈係数を示し、V はサンプルの体積を ml で示します [43]。

細胞培養物は、上記のように血清フラスコ内で調製および増殖させた。 異なる時間間隔で1 mlの培養物を取り出し、OD600を測定した。 培養物を、０．２２μｍの界面活性剤を含まない酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）を使用して濾過滅菌し、１．５ｍｌの微量遠心分離管に入れた。 無細胞上清は、酢酸塩の測定に使用するまで -4 °C で保存しました。 酢酸塩濃度は、プロトコールに従って比色アッセイキット (MAK086、Sigma-Aldrich) を使用して測定しました。 つまり、50 μl の無細胞上清を 50 μl のアッセイミックスに添加しました。 溶液を暗所で25℃で30分間インキュベートした。 酢酸塩濃度は、プレートリーダー (Eon, Biotek) で 450 nm で測定されました [44]。

デグレーダー細胞とクロスフィーダー細胞をマリンブロス (MB、Difco 2216) で培養し、25 °C で一晩増殖させました。 合計 1 ml の細胞培養物を 1.5 ml 微量遠心管中で遠心分離しました (13,000 rpm で 2 分間)。 上清を捨てた後、炭素源を含まないMBL最少培地1mlで細胞を洗浄した。 細胞を再度遠心分離し、細胞ペレットを0.002 OD600に調整した1 mlのMBLに再懸濁した。 合計 10 μl の細胞培養物を、上記の 190 μl の無細胞上清に添加しました。 培養物はプレートリーダー (Eon、BioTek) 内で 25 °C で増殖させました。 この増殖アッセイ後の無細胞上清は、マルチウェルフィルタープレート (AcroPrep) を使用して新鮮な 96 ウェルプレートに培養物を滅菌濾過することによって生成されました。 これらの上清を上記のように使用して、消費培地での増殖後の酢酸レベルを測定した。

厳選されたすべての画像解析データセットと図のソース データは Zenodo データ リポジトリにアップロードされており、公開と同時に利用できるようになります。 https://doi.org/10.5281/zenodo.6979866。

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最初のデータ分析にご協力いただいた Ben Roller 氏と Mateus de Oliveira Negreiros 氏に感謝いたします。 画像分析用のスクリプトを提供してくれた Alma Dal Co と Susan Schlegel。 Gabriele Micali、Guga Goram、Glen D'Souza にはデータ分析に関するディスカッションとアドバイスを提供していただきました。 Daan Kiviet はマイクロ流体成長デバイスの設計を担当しました。 また、このプロジェクトに関するフィードバックをくださった、微生物生態系の原則に関するシモンズ財団コラボレーションのメンバーにも感謝します。

医学博士と修士は、微生物生態系の原理に関するシモンズ財団コラボレーション (PriME #542389 および #542395)、スイス国立科学財団助成金 31003A_169978、チューリッヒ工科大学および Eawag の支援を受けました。 SvV は、スイス国立科学財団 Ambizione 助成金 PZ00P3_202186 によって支援されました。 スイス連邦工科大学チューリッヒ校が提供するオープンアクセス資金。

スイス連邦工科大学チューリッヒ校、生物地球化学・汚染力学研究所、環境システム科学部、微生物システム生態グループ

マイケル・ダニエルズ & マーティン・アッカーマン

Eawag 環境微生物学部: スイス連邦水生科学研究所、デューベンドルフ、スイス

マイケル・ダニエルズ & マーティン・アッカーマン

学際的博士課程プログラム システム生物学、スイス連邦工科大学チューリッヒ校およびチューリッヒ大学（スイス、チューリッヒ）

マイケル・ダニエルズ

Biozentrum、バーゼル大学、バーゼル、スイス

シモン・ヴァン・ブリート

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MD は MA とともにこの研究を考案しました。 MD はすべての実験を設計し、実行しました。 SvV は、セル セグメンテーション パイプラインから単一セルの成長ダイナミクスを計算するアルゴリズムを開発しました。 MD は、SvV と MA からの入力を使用してデータを分析しました。 MD は SvV と MA からの情報をもとに原稿を書きました。

マイケル・ダニエルズへの手紙。

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転載と許可

Daniels, M.、van Vliet, S. & Ackermann, M. 生態学的時間スケールにわたる相互作用の変化は、代謝的に結合した海洋微生物群集における単細胞の成長ダイナミクスに影響を与えます。 ISME J 17、406–416 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-022-01312-w

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受信日: 2022 年 2 月 3 日

受理日: 2022 年 8 月 23 日

公開日: 2023 年 1 月 7 日

発行日：2023年3月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01312-w

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