モジュール式自動マイクロ流体細胞培養プラットフォームは大脳皮質オルガノイドの解糖ストレスを軽減します

May 11, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 20173 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

Organ-on-a-chip システムは、マイクロ流体工学、細胞生物学、組織工学を組み合わせて、in vivo 対応物の生物学と生理学を再現する 3D 臓器固有の in vitro モデルを培養します。ここでは、ユーザー定義の培地流量で隔離された微小環境における個々のオルガノイドの培養を自動化する多重プラットフォームを開発しました。プログラム可能なワークフローにより、複数の試薬リザーバーを使用して直接分化、時間的変数の研究、培養の長期増殖に適用できます。ここでは、単一の PDMS 基板の上面と下面にフィーチャーを実現する、ポリジメチルシロキサン (PDMS) チップ製造における新しい技術について説明します。自動大脳皮質オルガノイド培養物の RNA シーケンス (RNA-seq) 解析では、従来の in vitro 細胞培養と比較して解糖ストレスおよび小胞体ストレスの軽減に利点があることが示されています。

細胞培養は、ヒト子宮頸がん生検から HeLa 細胞が単離されて以来、70 年以上にわたってヒトの病気と発症を研究するための主要なモデルとなってきました 1,2。もともとウイルスを研究する手段として使用されていたヒトの細胞培養プロトコルは、大量の物質を生産するために迅速かつ容易に増殖できるように最適化されました。組織培養プロトコルは進歩しており、特に多くの培地成分の削減が進んでいますが、これらのオリジナルのレシピの多くはそのまま残っています。生理的な栄養素の濃度、供給、除去を模倣するための組織培養プロトコルには、まだ改善の余地が多くあります。自動マイクロ流体工学により、手動では不可能な速度と精度で供給することで、従来のプロトコルを超えることができます。

幹細胞および発生生物学の最近の進歩により、ヒトの一次組織の側面に似た、より正確なモデルが生成されています 3,4。ヒト胚性幹 (hES) 細胞と人工多能性幹 (iPS) 細胞は、総称して多能性幹細胞 (PSC) と呼ばれ、体のほとんどの種類の細胞に分化する可能性があり、これを利用して 3D 培養モデルを生成するプロトコル脳、腸、肝臓、乳房などのヒト組織用5,6。オルガノイドと呼ばれるこれらの自己組織化する器官特異的な細胞培養物は、発生研究、病因学、医学における in vitro モデルとして広く利用されています 7、8、9。オルガノイドは、2D 細胞培養よりも、対応する一次組織の生理機能の主要な機能特性をより正確に模倣します6。オルガノイドは、in vitro モデルとしての使用を超えて、インプラント用組織としての再生医療やヘルスケアへの応用も検討されています5。この技術が新たな境地を開くにつれて、オルガノイド培養を増殖、制御、分析するためのより良い方法の必要性が高まっています。インビトロ培養物と初代組織との間のギャップを減らす必要がある。ここで示した進歩のような取り組みは、高精度マイクロ流体工学、ロボット自動化、非接触センシングを活用して、組織忠実度に最適化された堅牢で再現性のある細胞培養を可能にします。

PSC 由来オルガノイドは自己集合して多くの組織特異的な細胞型を生成する能力があるため、複雑な組織や系のモデル化に特に役立ちます。脳には人体の中で最も複雑な部分が含まれており、研究者はオルガノイド技術を使用してさまざまな脳領域の高品質モデルを生成できます。大脳オルガノイドは、大脳皮質の生理機能をモデル化した脳オルガノイドの一種であり、多くの皮質固有の細胞タイプとサブ領域が含まれています10。これらのオルガノイドは、出生前の脳の発達 11、12、13、脳の病理 14、および治療試験 15 の研究に広く使用されています。大脳オルガノイドは、長期培養中に直径数ミリメートルまで成長し、培養状態で無期限に維持できます16。

図 1 は、ヒト PSC を凝集させてヒト大脳オルガノイドを生成するプロセスを示しています17、18。神経誘導は、WNT (IWR1-\(\varepsilon\)) および Nodal/Activin (SB431542) 経路を阻害することによって達成され、背側皮質組織と腹側皮質組織の両方が得られます。オルガノイドの発生は胎児の初期発生と同様のペースで進行するため、後期段階の細胞型と組織構造を観察するには、これらの培養物を数週間から数か月維持する必要があります。これらには、ニューロン、アストロサイト、稀突起膠細胞などの最終分化した細胞タイプや、放射状グリア神経幹細胞から構成される局所的に組織化されたロゼットの観察が含まれます (図 1B)。大脳オルガノイドの現在のプロトコルには、スループット、一貫性、信頼性の点で限界があるだけでなく、健康障害もあり、細胞ストレスの顕著な兆候が見られます 19,20。細胞ストレスの表現型はおそらく多因子性です。ただし、多くの要因は従来の細胞培養に起因する可能性があります。手作業による培地交換のペース (多くの場合 1 ～ 3 日に 1 回) により、利用可能な栄養素が不規則に変動し、有毒な代謝産物が蓄積されます。インキュベーターの外で栄養を与えると、細胞はより低い温度を経験し、溶存二酸化炭素が減少し、よりアルカリ性の環境になります。これらの制御されていない変数の影響を軽減し、最小限の手動要件で長期的なメンテナンスを容易にする実験の量と質を向上させるために、ライフサイエンスではラボの自動化がますます普及しています。

人間の脳オルガノイド生成プロトコルの概要。 (A) ヒト多能性幹細胞は、大脳皮質組織の分化を促進するための規定の培地条件を使用して、従来の 2D 培養で増殖、解離、マイクロウェルへの凝集、3D オルガノイド培養への成熟が行われます。この研究では、凝集後 12 日目に、オルガノイドを懸濁液に保持して手動で維持するか (黒い矢印)、またはマイクロ流体チップの個々のウェルに移して自動で維持する (青い矢印) かのいずれかを行いました。 (B) 脳オルガノイド培養の画像。標準的な培養条件下での低倍率 (左) および高倍率 (中央) の明視野画像は、オルガノイドの形態と不均一性を示しています。 5 週目の免疫蛍光染色。PAX6 (緑色、放射状グリア前駆細胞)、CTIP2 (BCL11B) (マゼンタ、興奮性投射ニューロン)、ZO-1 (TJP1) (白色、放射状グリア末端の足、神経の頂端表面上の密着結合タンパク質)チューブ）、ニューロンに囲まれた放射状グリアを持つ特徴的な心室帯状のロゼット構造を示します。 DAPI で染色された核 (青)。 (C) PDMS マイクロ流体チップの画像。標準的な 24 ウェルプレートをモデルにしたカスタム細胞培養チップには、自動実験用のオルガノイドが収容されています。

従来の細胞培養では、液体の分注、移動、除去はすべてのプロトコルで必要なアクションです。したがって、液体の取り扱いと液体試薬の適切な保管は、このプロセスを自動化するための重要な機能です。現在の液体ハンドリング技術は、連続フロー技術とデジタルマイクロフルイディクスの 2 つのカテゴリに大別されます21。連続フローシステムは、圧力ポンプ、機械ポンプ、または動電ポンプによって生成される定常状態の液体の流れに依存します。一定の流れにより、これらのシステムは速度と均一性を高度に制御します。ただし、複雑な流体操作には柔軟性が低く、スケール変更が困難です。連続流から派生した閉鎖チャネルシステムは本質的にアクセスが難しく、閉じ込められたガスの管理が必要であり、単一の場所での流れを制御するパラメーターがシステム全体の特性に依存するため、拡張性が高くありません。

対照的に、液滴ベースまたはセグメント化されたフローのマイクロフルイディクスは、個別の体積を制御するため、液滴操作 22、混合、カプセル化、選別、センシング、およびハイスループット実験 23 に便利です。液滴ベースのマイクロ流体工学は、バルブと組み合わせることで、液滴に対してほとんどの論理操作を実行して、分類、結合、分割を行うことができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) は、低コスト、試作の多用途性、および高いガス透過性により、マイクロ流体デバイスを製造するための最も一般的な材料です 24。液滴ベースのマイクロ流体工学は、供給頻度のスケジュール設定など、手作業では不可能または非現実的な制御の多くの機会を生み出しました。どちらのテクノロジーにも、さまざまな接触アプローチと非接触アプローチがあります25。コンタクトリキッドハンドラーでは、ピペッティングと同様に、より高い精度と制御で基板に接触する液体を含むチップが必要です。非接触液体ハンドラーは、流体の圧力と速度を操作して流れを制御します。どちらのテクノロジーも、超低容量 (ナノリットル) および超低流量 (マイクロリットル/時間) まで進歩しました。

オルガノイドは通常、プレートの単一ウェルに複数のオルガノイドを懸濁してバッチで増殖させます。単一ウェル内の共有条件により、バッチの一貫性がサポートされます。ただし、複数の遺伝子型を持つ実験など、実験内の変数の数が増えると、スループットが難しくなります。さらに、マルチウェルプレートは、動的条件の制御や培地中の濃度勾配の生成にはあまり適していません。対照的に、オルガノイド培養チャンバーとしてのマイクロ流体チップは、高い時空間分解能で環境条件を正確に制御することを可能にする 26,27。連続希釈により自動勾配を実現でき、ロボットによる体積流量によりハイスループット実験を効率的に管理できます。研究室の自動化のためのデバイスの選択では、用途、柔軟性、コストを考慮する必要があります。細胞培養の微小環境を考慮すると、ここで開発されたものと同様の非接触システムは、栄養素濃度の恒常性を維持し、代謝副産物の蓄積を減らし、生体内条件により近いせん断力を生成するという重要な利点を提供します。

ここで我々は、長時間の細胞培養を自動化するための、セグメント化された供給を備えたPDMSベースの非接触マイクロ流体プラットフォームを開発した。このプラットフォームは、多くのオルガノイドプロトコルおよびグラジエントアッセイに合わせて構成可能です。プラットフォームインターフェイスにより、モノのインターネットを介したインキュベータイメージングシステムなどの他の研究機器との統合が可能になります。私たちは、人間の大脳皮質オルガノイドの成長と発達をサポートする能力をテストすることで、このプラットフォームを評価しました。

私たちは、3D オルガノイドの成長を最適化するための自動マイクロ流体細胞培養プラットフォーム、「自動培養」プラットフォームを開発しました。このシステムは、6 つのリンクされたモジュールで構成されます (図 2): (1) 試薬リザーバー (新鮮な培地など) を備えた冷蔵庫、(2) シリンジポンプ、分配バルブ、および制御インターフェイス、(3) 冷蔵保管庫内の馴化培地収集リザーバー(4) 細胞培養インキュベーターと接続するマイクロ流体シリアルバス、および (5) (6) 微小環境容器 (24 ウェルのうち 1 つ) 内にオルガノイドを固定化する多重化マイクロ流体オルガノイドチップ。オルガノイドに栄養を与えるために、各ウェルは流体コントローラーによってサービスされます。コントローラーは、使用済みの培地を冷蔵保管庫内のコレクターに吸引して除去し、プログラム可能な間隔で容器に新しい培地を補充します。

このシステムの 24 個のウェルはそれぞれ、専用のインレットチューブ、アウトレットチューブ、および収集リザーバーを備えた個別の隔離された実験です。各ウェルの供給スケジュールは速度と培地を完全にカスタマイズできるため、実験の柔軟性が向上します。 3 つの培地/試薬リザーバーからの 5 ～ 1000 \(\upmu \hbox {L}\) の範囲のアリコートを任意のウェルにスケジュールできます。培地/試薬リザーバーを組み合わせて使用することもできます。設計により、各ウェルはプレート上の他の回路からの絶縁を維持する流体回路を形成します (「方法」を参照)。完全な 24 ウェルプレートは 72 秒で整備され、液体注入の間隔はそれを超えても構いません (たとえば、1 時間ごと、1 日 2 回、隔日など)。馴化培地は、実験中または実験後のどの時点でも培養を中断することなく、分子分析のために回収できます。収集のために採取された馴化培地は、ライン内のアイドル培地から発生する可能性のある感染のリスクを軽減するために、流出流体チャネル内の空気相によって培養物から分離されます。実験後、オルガノイドは分子分析のために回収されます。

自動化されたマイクロ流体培養プラットフォームの設計と実装。 (A) 自動マイクロ流体オルガノイド培養プラットフォーム、Autoculture の図。 (B) Autoculture の正面画像。 (1) 試薬リザーバーを備えた冷蔵庫。 (2) シリンジポンプ、分配バルブ、および制御インターフェース。 (3) 馴化培地収集リザーバーを備えた冷蔵庫。これらのコンポーネントは、細胞培養インキュベーターの真上にある実験台に置かれています。 (4) マイクロ流体チューブはインキュベーターのポートを通って入り、インキュベーター内の (5) マイクロ流体ウェルプレートチップに接続します。 (6) オルガノイド培養物を含む単一ウェルの断面図。

これらの制御パラメーターを使用すると、プレート全体で同じワークフローを実行して、オルガノイドの一貫したバッチを生成できます。ウェル 1 からウェル 24 まで段階的な濃度勾配で試薬を滴定することもできます。さらに、プレート全体で複数のプロトコル/供給スケジュールを実行し、実験全体のさまざまな時点で培地成分または供給スケジュールを変更することができます。

アマゾンウェブサービス (AWS) のモノのインターネット (IoT) は、複数のデバイスが情報を通信してアクションを開始するための便利な制御フレームワークを提供します。メッセージキューテレメトリトランスポート (MQTT) などの通信プロトコルを使用すると、システムは、インターネットを介してリアルタイムで同期および調整された制御とデータ取得の取り組みを管理できます28。システム間の通信はローカルエリアネットワーク (LAN) 経由で行われ、研究者はリモートからデータやアクションをオンデマンドで呼び出すことができます。そのため、Autoculture ソフトウェアアーキテクチャは、AWS クラウドからオンデマンドで実験の設計、開始、一時停止、編集、停止を制御できます (図 3)。

IoT クラウド統合: インターネット上でホストされるグラフィカルユーザーインターフェイスは、MQTT 経由で Autoculture プラットフォームにメッセージを中継し、実験を開始、監視、終了します。

Raspberry Pi 計算モジュールは、実験をローカルで実行し、MQTT 経由で中継されたコマンドを受け入れるために使用されました。 Tecan のポンプとバルブにシリアルコマンドを送信するために使用されるアプリケーションプログラムインターフェイス (API) は、オープンソースの Python パッケージから採用されました29。実験を実行するためのプロトコルは、ポンプとバルブに対する単位動作のタイミングシーケンスによって開発されました。ユーザーとして、自動実験を構築するために利用できるパラメーターと範囲を表 1 に示します。このアーキテクチャでは、IoT 接続により、実験をリモートで操作するためのアクセスが可能になり、デバイス上でローカルに操作されるスケジュールにより、インターネットが不安定な場合でも操作の安全性が確保されます。繋がり。

図 4 は、PDMS マイクロ流体チップの製造および組み立てプロセスを示しています。光学的に透明なガラス PDMS マイクロ流体チップは、顕微鏡、プレートリーダー、ロボットディスペンサーなどの実験ツールと統合できる 24 ウェルプレート (85.5 mm × 127.6 mm) の設置面積を備えています。 24 個の隔離されたウェルは、ガラスと PDMS の境界面にある 2 mm 四方のチャネルを介してアドレス指定可能です。アクセスしやすいように、すべてのインレットはチップ面の端に一列に配置され、すべてのアウトレットは反対側の端に一列に配置されています。ここでのオープンループマイクロ流体設計には、空気に開放されたウェルが含まれています。このようにして、システム内に蓄積された気泡が排出され、インキュベーター環境との自由なガス交換が行われ、チップのロード中および実験の結論中にオルガノイドに簡単にアクセスできます。各ウェルには 120 \(\upmu \hbox {L}\) がトラップされており、細胞外足場の使用を含め、微小環境として使用できます。流体チャネルの入口と出口はウェルの底から 5 mm 上にあるため、非付着サンプルが流出チャネルに失われるリスクを軽減できます。

PDMS マイクロ流体チップの製造。 (A) マイクロ流体チップアセンブリ内の PDMS 基板の連動モールドパターンのグラフィックレンダリング。 (B) インターロックマウント (青、赤、緑) がベースモールド (紫) に固定され、基板が硬化する際に保持される、流し込まれた PDMS 上にマイクロ流体幾何学形状が定義されます。 (C) PDMS 基板を型から取り外し、ガラスに貼り付けます。 (D) チップの断面図。流体は表面のマイクロ流体入口から入り、底部のガラスで密閉されたチャネルをたどって、上部からアクセスできるウェルまで流れます。 (E) 3D プリントされた流体インターフェイスプレート (黄色) は、24 の流体マイクロチューブラインとマイクロ流体チップの入口/出口を接続します。 (F) マイクロ流体チップ (中央) と流体インターフェイスプレートの例 (左) および完全に取り付けられた流体インターフェイスプレート (右)。

3D プリントされた各流体インターフェースプレートは 24 のラインを同時に接続します (図 4F)。これは、PDMS ベースのマイクロ流体で一般的な各ラインを個別に挿入するのに比べて簡素化されます。流体インターフェイスプレートのチューブインサートの内側では、3 つの円形バーブが Tygon チューブを剛性の突起にシールします。チューブを有する剛性の突起は、マイクロ流体チップのチャネルアクセス穴に位置合わせされる。 24 本のラインの集合体が PDMS の成形穴と嵌合すると、すべてのプレートの突起でボアシールが形成され、プラットフォームのチューブラインがマイクロ流体チップのチャネルに位置合わせされます。

発生の 12 日目に、脳オルガノイド培養物をオービタルシェーカー (図 5A) から自動マイクロ流体ウェル (図 5B) に移しました。軌道シェーカーは、約 0.12 m/s の準定常速度領域を維持します 30,31,32。 Comsol Multiphysics33 を使用して数値流体力学シミュレーション (CFD) を実行しました (図 5C)。ウェルに注入される培地の最初の 2.2 秒を表します。液体はガラス床から 5 mm 上の入口から入り、傾斜した壁を通ってウェルに入ります。シミュレーションは、入口/出口ポートのレベルまで満たされた媒体液体ドメインとその上に存在する空気ドメインから始まります。供給時には、媒体がキャビティに入り、入口から出口まで進む波を生成します。球体としてモデル化されたオルガノイドは、空気と媒体の境界面の 5 mm 下に固定されており、生成される乱流のほとんどは観察されません。下部 (ガラス) 基板は、送り中に最大速度の \(<5\%\) を受けます。この領域の速度は（準定常状態とは対照的に）瞬間的であり、オービタルシェーカーの速度よりも 2 桁小さいため、培養物に対する速度が低下し、せん断応力が小さくなります。このシステムの利点の 1 つは、研究者が培地の流量と送達スケジュールを調整して、オルガノイドへの破壊を最小限に抑えながら栄養素の最適な拡散を達成できることです。

自動システムを使用して、数値流体力学により個々の組織培養ウェル内の流れをシミュレートしました。 (A) オルガノイド培養物は、オービタルシェーカー上で回転するウェルプレート上で展開されます。 (B) 12 日後、オルガノイドを自動マイクロ流体ウェルに移植します。 (C) 提案された自動システムの 1 つのウェル。速度流線を使用して 2 秒以上の一定の流体注入を行います。

18 日間の実験で、自動培養での脳オルガノイドの成長をオービタルシェーカー条件での成長と比較しました。ヒト多能性幹細胞を凝集させてオルガノイドを形成し、神経誘導中の最初の 12 日間は標準条件下で維持しました (「方法」を参照)。バッチを分割し、12 個のオルガノイドを Autoculture マイクロ流体チップにロードし、残りはコントロールとしてオービタルシェーカー上の 6 ウェルプレートに維持しました。オルガノイドをロードする直前に、各ウェルに 50 \(\upmu \hbox {l}\) マトリゲルを事前にロードして、各オルガノイドをウェルの中心に接着させました (「方法」を参照)。自動オルガノイドには 6 日間、1 時間ごとに 70 \(\upmu \hbox {L}\) が与えられましたが、対照には 1 日おきに 2 mL が与えられました。自動化では、栄養補給のためにウェルプレートをインキュベーターから定期的に取り出す必要はありません。したがって、このシステムはオルガノイドの発生を長期的にモニタリングするのに適しています。この研究では、明視野イメージングインキュベータープラットフォームを使用して、自動培養ウェルプレート内のオルガノイドを 1 時間に 1 回モニタリングしました 34,35。

図 6A は、遠隔制御の IoT 対応マルチウェル自動イメージングシステム上に配置されたインキュベーター内の自動マイクロ流体培養プレートを示しています。このイメージングシステムは、各ウェルに 1 台の専用カメラを使用して、24 ウェルプレート形式で生物学的実験を監視するように設計されました。実験全体を通してオルガノイドの三次元発達を説明するために、三次元組織全体をカバーする焦点距離の範囲にわたって画像のバーストを撮影しました。コンピュータービジョンアルゴリズムを使用して、各焦点面で焦点が合っている特徴を検出し、オルガノイド全体で焦点が合っている特徴を最大化する合成画像を生成し、投影面積を計算しました。このプロセスは以前の研究で説明されています35。図 6B は、マイクロ流体チップの個々のウェルにロードされ、実験のために自動培養プラットフォーム上で並行して供給された 12 個の大脳皮質オルガノイド培養物 (12 日目) を示しています。図 6C、D は、連続 6 日間にわたる「培養物 4」の成長を示しています。自動培養ウェル内のオルガノイドでは堅調なオルガノイドの成長が観察され、これは対照条件下で成長したオルガノイドで観察されたサイズの増加と一致していました。対照と比較して、自動化オルガノイドは実際に密度の低い周囲を発達させ、速度とせん断力の低下が、そうでなければ切断されるであろう成長と移動に適応する可能性があることを示唆しています。

18 日目に培養物を採取し、バルク RNA シーケンス (RNA-seq) および免疫組織化学によって分析し、各条件で生成された細胞の種類と細胞培養物の全体的な健全性を評価しました。 7 つの「自動」オルガノイドと 4 つの「懸濁」オルガノイドのトランスクリプトームを比較しました。神経上皮 (SOX2)、橈骨グリア神経幹細胞 (SOX2、HES5、PAX6、HOPX)、中間前駆細胞 (EOMES)、および未熟ニューロン (NeuroD1、RELN) の細胞型マーカーの遺伝子発現は、自動培養間で一貫した差異を示さなかったおよび対照サンプルは、全体的な分化忠実度が自動培養システムの使用によって影響を受けなかったことを示唆しています（図 7A）。これと一致して、標準または自動培養条件下で増殖させたオルガノイドの切片において、免疫組織化学により、神経前駆タンパク質マーカーであるSOX2およびネスチンの強力な発現が見られた(図7B)。

オルガノイド発生の長期的モニタリング。 (A) Autoculture マイクロ流体チップは、リモート制御された IoT 対応の 24 ウェル自動イメージングシステム上にあります。 (B) 自動給餌の 1 日目における 12 個の個別の 12 日齢の大脳皮質培養物の明視野画像。 (C) 実験中の「文化 4」の縦断イメージング。 (D) 実験中の「文化 4」の投影面積拡大。これは、コンピュータビジョンアルゴリズムを使用して取得されました34。

自動オルガノイドと対照オルガノイドを比較すると、細胞培養ストレスに関連する遺伝子の発現に大きな違いがあることが観察されました。研究により、オルガノイドでは解糖および小胞体ストレス（ER ストレス）経路が in vivo 組織サンプルと比較して上方制御されており、これらは細胞サブタイプの特定および成熟の障害と相関していることが示されています 17,19。この研究では、標準解糖系が最上位の遅延経路であり、重要な遺伝子の大部分が一貫して下方制御されていました（補足表2および3を参照）。大脳オルガノイドで特に上方制御されている遺伝子は、自動化条件でレベルの低下を示しました。ALDOA、ENO1、HK1、およびPGK1は、それぞれ-6.9、-10.4、-2.8、および-9.3の倍率変化を示しました（図7A）。さらに、ER ストレスのマーカー: ARCN1、GORASP2、および YIPF1 は、それぞれ - 2.8、- 2.2、および - 3.0 倍の変化で減少しました。より優先的に発現されるERストレスの遺伝子については、補足表4を参照してください。

転写および免疫蛍光イメージングの結果。 (A) 神経分化、解糖、および小胞体ストレスに関連する選択遺伝子の発現のペアワイズ比較。結果は、神経分化の HOPX および NES を除き、調整後の p 値 ≤ 0.05 で統計的に有意でした。「自動」データは 7 つの生物学的複製を表し、「懸濁液」データは 6 つの技術的複製を含む 4 つの生物学的複製を表します (B) 懸濁液および自動オルガノイド切片の SOX2、ネスチン、および DAPI の免疫蛍光染色は、一致する前駆体マーカーを示します。

長期にわたる実験、再現性、並列化、長期分析に対する需要の高まりにより、細胞培養は自動化に向かいます。この研究は、モノのインターネット上で他の制御およびセンシングデバイスと連携して存在できるオルガノイドの成長と維持のための自動化されたマイクロ流体ソリューションを紹介し、自動化された実験のための精密ロボット工学を活用する能力を拡大します。このプラットフォームとここで示すイメージングプラットフォーム (図 6) を組み合わせることで、時間の経過に伴う個々のオルガノイドのライブ研究を独自に可能にする静止環境が提供されます。このプラットフォームは、他のオルガノイドモデルや生体外組織の維持に簡単に使用できます。ここで説明する 24 プレックスマイクロ流体チップは、細胞をロードする前にマイクロ流体チップを細胞接着表面コーティングで処理する追加のプロトコルステップを含めることで、接着 (2D) 培養の増殖をサポートするように適合させることもできます。

長期オルガノイド培養のためのオービタルシェーカーの使用は、この分野で広く採用されており、栄養素の拡散と溶存ガスの均一性に利益をもたらします。しかし、存在する流体の速度とせん断力は胚の環境とは似ていません。ここに示したシステムのようなマイクロフルイディクスを使用して、流速、せん断力、圧力勾配を調整すると同時に、急速な栄養補給計画を通じて栄養分と溶存ガスの濃度に同じ利点を提供できます。当社のシステムは低速環境を可能にします。ここで示した CFD シミュレーション (図 5) は、低速に対して優先的に選択された検証実験の条件を表しています。ただし、増殖率が高くなると、オルガノイドの形態や分化への影響を研究するために使用できる速度勾配が高くなる可能性があります。

脳オルガノイドモデルのストレスレベルを下げることは、生理学的関連性を達成するために重要です。解糖酵素発現の減少によって測定されるように、自動培養プラットフォームの環境では、従来の浮遊培養条件と比較してストレスの少ないオルガノイドが得られます。糖代謝、低酸素モニタリング、タンパク質生成などの環境条件に応答する経路は、統合されたストレス応答経路を通じて相互接続されています。自動供給によって細胞培養培地の濃度変動を減らすことにより、培養物の恒常性がさらに高まる可能性があります。解糖系および小胞体ストレス遺伝子の遺伝子発現低下の潜在的な長期的影響と、我々が観察した細胞ストレスの軽減に関連する遺伝子発現サインの根底にある重要な環境条件を理解するには、さらなる調査が必要である。たとえば、グルコースなどの必須栄養素の枯渇、または乳糖などの細胞代謝産物の蓄積が、標準的なオルガノイド培養条件下で観察される解糖経路における遺伝子の誘導を引き起こす重要な要因であるかどうかは不明です。ただし、ここで開発した Autoculture システムは、この問題を体系的に調査できるプラットフォームを提供します。

細胞培養培地は、マルチポート溶媒送達キャップ (Spex VapLock) を備えたガラスボトルリザーバー (Corning) に保管し、実験期間中 \(4^{\circ }\hbox {C}\) に保管しました。各リザーバー送出キャップには、リザーバーの底部からリザーバーの入口ポートまで延びる、2 ピース PTFE ナットとフェラルネジ付きアダプター (Spex VapLock) によってシールされた単一の内径 0.030 インチ × 外径 0.090 インチの Tygon マイクロボアチューブ (Masterflex) が含まれていました。シリンジポンプの 6 ポートセラミックバルブヘッド (Tecan Cavro Centris、1.0 mL ガラスバイアル)。シリンジポンプ試薬の吸引を補うために、キャップに取り付けられた 0.22\(\upmu \hbox {m}\) フィルター (Millipore) を通して滅菌空気をリザーバーに再充填することができます。同じ Tygon マイクロボアチューブと PTFE ナットおよびフェルールネジ付きアダプターを使用して、シリンジポンプを 2 つの並列 12 ポート分配バルブ (Tecan SmartValve) に接続しました。分配バルブから出ている各 0.020 インチ ID × 0.060 インチ OD Tygon マイクロボアチューブ (Masterflex) は、マイクロ流体チップの単一ウェルに接続されます。ウェル間の流体分離は、この接合部以降維持されます。各 12 ポート分配バルブは、マイクロ流体チップ上の 6 つのウェルにサービスを提供します。分配バルブを 2 つおよび 4 つ備えたシステムが構築されました。長さ 2 m のマイクロボアチューブの集合体を、取り扱いを容易にするために三つ編みに束ね、標準的な細胞培養インキュベーター (Panasonic) の後部入口ポートに通しました (図 2(4))。インキュベーター条件 (\(37^{\circ }\hbox {C}\)、5% CO2、95% 相対湿度) で、3D プリントされた単一のカスタム流体インターフェースプレートが試薬送達用のマイクロボアチューブのセットと嵌合しました。をマイクロ流体チップの入口に接続し、出口への試薬吸引用のマイクロボアチューブのセットに第 2 の同一のインターフェースプレートを接続しました。

吸引用のマイクロボアチューブをインキュベーターから戻し、馴化培地収集用の使い捨て 15 mL コニカルチューブ (Falcon) のセットに導きました (図 2(3))。各収集リザーバーは、2 つの 0.06 インチのドリル穴を含むゴム製ストッパー (McMaster) で蓋をされました。各ストッパーについて、マイクロ流体チップから馴化培地を供給するマイクロボアチューブが 1 つの穴に挿入され、空気圧操作用の乾燥したマイクロボアチューブが元の穴に戻ります。吸引分配バルブヘッドをもう一方の穴に挿入し、シリンジポンプを使用して各収集リザーバーに負圧を直列に発生させ、馴化培地をマイクロ流体チップから収集リザーバーに引き込みました。すべてのマイクロボアチューブは、PTFE ナットとフェラルネジ付きアダプターを使用して分配バルブとシリンジポンプに気密封止されました。

シリンジポンプと分配バルブは、Tecan マニュアルに記載されているマルチポンプ電気配線構成を使用して接続されました。コンピューティングモジュール (Raspberry Pi 4) は、GPIO TX/RX を使用して、Raspberry Pi 用 DB9M RS232 シリアル拡張ボード (Ableconn) への Tecan OEM 通信プロトコルによるシリアル通信を中継しました。 Raspberry Pi 計算モジュールは、プロトコルの編集と起動に 7 インチのタッチスクリーンディスプレイを使用しました。自動化でプロトコルを実行するために必要なソフトウェアの開発には、オープンソースの Python アプリケーションプログラムインターフェイス (API) が使用されました29。

PDMS ベースのマイクロ流体工学は、連動する 3D プリントされたプラスチックモールドを使用して構築されました (図 4)。これらは、モデル V2 樹脂を使用して SLA プリンター (Formlabs Form 3) で印刷されました。印刷されたモールドは、イソプロパノール (IPA) 中で 20 分間超音波処理して後処理して過剰な樹脂を除去し、その後 N2 中で乾燥させました。乾燥したコンポーネントを UV 光 (405 nm) で \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) で 30 分間硬化させました。図３に示すように、型部品を組み立て、ＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤（１０：１ｗ／ｗ）を混合することによって調製したＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）を充填した。型に充填した後、PDMS を真空チャンバー内で 1 時間脱気しました。 PDMS が充填された金型は、金型から PDMS を取り外す前に \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) で 24 時間放置して硬化させます。

ホウケイ酸ガラス基板 (\(101.6\hbox {mm} \times 127.0\hbox {mm}\)、McMaster-Carr) を、アセトン (10 分間)、次にイソプロピルアルコール (10 分間) 中で超音波処理して洗浄し、N2 で乾燥させました。。ガラス基板と成形 PDMS 表面を 50 W の酸素プラズマで 45 秒間活性化しました。ガラスと PDMS (図 4C) を手で位置合わせし、一緒に押し付け、ホットプレート上で \(100\,^{\circ }\hbox {C}\) で 30 分間焼き、不可逆的なシールを形成しました。

PDMS による小分子の吸収を防ぐために、パリレン C (Specialty Coating Systems) の 10 \(\upmu \hbox {m}\) 層がマイクロ流体チップ上に堆積されました。付着を促進するために、２滴のシランＡ－１７４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を堆積チャンバに導入した。

流体インターフェースプレート（図４Ｆ）を３Ｄプリントして、外径２．２ｍｍのマイクロボアチューブ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ）とＰＤＭＳ入口および出口機構とをインターフェースした。各コネクタの形状は、外径 2.7 mm、内径 2.2 mm の 24 個の円筒形の押出成形品で構成されています。各ボア内には、挿入時にマイクロボアチューブを掴むための長さ 0.2 mm の返しが 3 つありました。このコンポーネントは、Formlabs SLA プリンター (Form 2) でサージカルガイド樹脂を使用し、イソプロパノール (IPA) 中で 20 分間超音波処理して過剰な樹脂を除去し、その後 N2 で乾燥させて印刷しました。次に、乾燥したコンポーネントを UV 光 (405 nm) で \(60\,^{\circ }\hbox {C}\) で 30 分間硬化させました。生体適合性を確保するために、部品は 5 \(\upmu \hbox {m}\) のパリレン C (Specialty Coating Systems) でコーティングされました。接着を促進するために、シラン A-174 (Sigma-Aldrich) も 2 滴、デバイスを備えた堆積チャンバーにロードされました。

シリンジポンプ、バルブヘッド、チューブ、流体インターフェースプレート、およびコレクションチューブキャップの滅菌は、供給元 (Tecan) の推奨に従って実行されました。オートクレーブ処理したガラス製リザーバーから供給された 70% エタノールで 10 分間洗浄し、シリンジポンプを介してプラットフォームを通して収集リザーバーに押し出しました。 70% エタノールに続いて、0.22 \(\upmu \hbox {m}\) フィルター (Millipore) を通して供給される無菌空気の乾燥サイクルを 10 分間適用しました。続いて、脱イオン無核水と乾燥の 10 サイクルを同じパラメータの下で実行しました。マイクロ流体チップと培地リザーバーを \(121^{\circ }\hbox {C}\) で 45 分間オートクレーブし、使用直前に 15 分間乾燥させました。すべてのコンポーネントは、オルガノイドと培地をロードするために、密封されたオートクレーブ可能なバッグを介して組織培養のバイオセーフティキャビネットに移されました。事前に調製され、補充された培地を各培地リザーバーに移し、蓋をして (VapLock)、実験期間中冷蔵保存しました。

ヒト胚性幹細胞株 H9 (WiCell、供給元で認証) を、StemFlex Medium (Gibco) 中の組換えヒトビトロネクチン (Thermo) でコーティングされた細胞培養皿上で増殖させました。プレートを０．５ｍＭＥＤＴＡとともに５分間インキュベートすることによって継代培養を実施し、その後、培地中に再懸濁して、新しいコーティングされたプレートに移した。

大脳オルガノイドを生成するために、Accutase Cell Dissociation Reagent (Gibco) を使用して接着培養物を単一細胞に解離し、次に 2 mL の AggreWell Medium (STEMCELL Technologies) を使用してウェルあたり 3,000,000 細胞の密度で AggreWell 800 24 ウェルプレート (STEMCELL Technologies) に凝集させました。）Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632、10 \(\upmu \hbox {M}\)、Tocris、1254）を補充しました（0日目）。翌日 (1 日目)、1 mL の AggreWell 培地を、WNT 阻害剤 (IWR1-\(\varepsilon\), 3 \(\upmu \hbox {M}\), Cayman Chemical, 13659, 1～10日目）およびNodal/Activin阻害剤（SB431542、Tocris、1614、5 \(\upmu \hbox {M}\)、1～10日目）。 2 日目に、p1000 ワイドボアピペットを使用して AggreWell プレートから注意深く吸引することにより、凝集体を 37 \(\upmu \hbox {m}\) フィルター (STEMCELL Technologies) に移しました。フィルターを反転し、新鮮なAggreWell培地ですすぐことによって、オルガノイドを超低接着6ウェルプレート(Corning)に移した。培地は、3、4、5、6、8、および 10 日目に、2 mL の馴化培地を新しい培地と手動で交換することによって交換されました。 11日目以降、培地をEagle培地：GlutaMAXサプリメントを含む栄養混合物F-12（DMEM/F12、Thermo Fisher Scientific、10565018）、1X N-2 Supplement（Thermo Fisher Scientific、17502048）を含む神経分化培地に交換しました。、1X 化学的に定義された脂質濃縮物 (Thermo Fisher Scientific、11905031)、および 0.1% 組換えヒト線維芽細胞成長因子 b (Alamone F-170) および 0.1% 組換えヒト上皮成長因子を添加した 100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン (R&D システム 236) -例えば）。

対照群の「懸濁」オルガノイドは、6ウェルプレートに懸濁したままであり、培養の残りの間、1日おきに2 mLの培地を交換して維持した。実験グループの「自動」オルガノイドはマイクロ流体チップにロードされ、残りの培養では 1 時間ごとに 70 \(\upmu \hbox {L}\) の培地交換を経験しました。

脳オルガノイド分化の 12 日目に、50 \(\upmu \hbox {L}\) の冷却した (約 \(0\,^{\circ }\hbox {C}\)) マトリゲルをピペッティングすることによってマイクロ流体チップを調製しました。 hESC Qualif Matrix (BD 354277) を各ウェルに注入します。マトリゲルの直後、単一の脳オルガノイドを、70 \(\upmu \hbox {L}\) のネイティブ馴化培地とともに p1000 ワイドボアピペットを介して各ウェルに移し、イメージングのために中央ウェルに配置しました。チップを 24 ウェルプレートの蓋で覆い、\(37^{\circ }\hbox {C}\) で 15 分間インキュベートしてマトリゲルを固定しました。各ウェルを追加の 70 \(\upmu \hbox {L}\) の新鮮な培地で満たし、後部アクセスポートを介してインキュベーター内に送られた流体インターフェイスプレート (図 4F) に接続しました。流体インターフェースプレートをマイクロ流体チップに手動で圧入し、チップをイメージングプラットフォーム上に配置しました（該当する場合）。

Smart-seq2 プロトコル 36 を使用して、オルガノイド mRNA 全体から完全長 cDNA シーケンシングライブラリーを生成しました。簡単に説明すると、溶解バッファーを使用してオルガノイド全体を溶解し、オリゴDTプライマー（/5Me-isodC/AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN）を使用してSuperscript III（ThermoFisher Scientific）で逆転写されたポリアデニル化mRNAを含む細胞溶解物をレンダリングし、テンプレートスイッチオリゴを使用してテンプレートスイッチを実行しました。 (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG)。オリゴＤＴプライマーおよびテンプレートスイッチオリゴ配列は、下流のｃＤＮＡ増幅のためのプライマー部位として機能した（ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ）。 Qubit 3.0 DNA 高感度蛍光アッセイを使用して cDNA を定量し、バイオアナライザー DNA 高感度キット (Agilent) を使用して品質を評価しました。 Nextera HT トランスポザーゼ (Illumina) を使用して、1 ng の cDNA をバーコード化された配列決定ライブラリーに変換しました。

ペアエンドリードは Illumina NextSeq 550 で 75 × 75 bp でシーケンスされ、さらに深さは Illumina NovaSeq 6000 で 50 × 50 bp でサンプルあたり 6,500 万ペアリードの平均リード深度までシーケンスされました。サンプルは Illumina i5 および i7 バーコードを使用して多重分離され、より深度の高いサンプルは SAMtools37 を使用して 100M までサブサンプリングされました。トリムされたリードは結合され、toil-rnaseq パイプライン 39 を使用して STAR アライメント 38 (Gencode v37) でヒトゲノム (hg38 UCSC アセンブリ) にアライメントされました。 STAR パラメータは ENCODE の DCC パイプラインから取得されました40。 RStudio の DESeq241 パッケージを使用して、差次的遺伝子発現を実行しました。遺伝子セット濃縮分析は、g:Profiler42 を使用して実行されました。

大脳オルガノイドを収集し、4% パラホルムアルデヒド (ThermoFisher Scientific #28908) で固定し、1X PBS で洗浄し、飽和するまで PBS 溶液中の 30% スクロース (Millipore Sigma #S8501) に浸しました。サンプルを組織凍結培地（General Data、TFM-C）を含むクライオモールド（Sakura - Tissue-Tek Cryomold）に包埋し、- \(80\,^{\circ }\hbox {C}\) で凍結して保存しました。オルガノイドは、クライオスタット (Leica Biosystems #CM3050) を使用して 18 \(\upmu \hbox {M}\) でスライドガラス上に切片化されました。オルガノイド切片を1X PBSで10分間3回洗浄した後、PBSブロッキング溶液(ThermoFisher Scientific #BP1605-100)中の10% BSAで2時間インキュベートした。次に切片を、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体中で \(4^{\circ }\hbox {C}\) で一晩インキュベートしました。翌日、切片を1X PBSで30分間3回洗浄しました。次いで、それらを、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体の溶液中で室温で２時間インキュベートした。切片をさらに 3 回、1X PBS で 30 分間洗浄しました。

使用した一次抗体は、ウサギ抗 SOX2 (ab97959、1:250 希釈)、ニワトリ抗 Nestin (ab134017、1:250 希釈)、および DAPI (Sigma D9542-10mg) でした。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 594 (ab150080、1:250 希釈) およびヤギ抗ニワトリ Alexa Fluor 488 (ab150169、1:250 希釈) でした。イメージングは、UC Santa Cruz Institute for the Biology of Stem Cells (RRID:SCR_021135) の Zeiss Axioimager Z2 Widefield Microscope と Zen Pro ソフトウェアを使用して行われました。画像はImageJを使用して処理されました。

ウェルの充填および排出の流体力学は、市販の数値流体力学ソフトウェア COMSOL®Multiphysics 5.5 (ストックホルム、スウェーデン) を使用して予測されました。図 5B は、平均速度 \(9.85 \times 10^4\,\hbox {m) で配信されたメディアの充填サイクル (\(70\, {\upmu }\hbox {L}\) の最初の 2 秒を示しています/s}\))。井戸の深さは \(5\,\hbox {mm}\) で、直径は \(5.6\,\hbox {mm}\) です。このシミュレーションでは、メディアの特性は \(997\,\hbox {kg/m}^3\) の密度と \(6.92 \times 10^3\,\hbox {kg/ms}\) の粘度でした。シミュレーションでは、相境界 (液体と空気の間) を自由表面として予測します 43。ソリューションドメインは、「滑り止め」境界条件を持つ硬い壁 (ウェル) と、「滑り」境界条件を持つインキュベーターに開いた上面 (空気と媒体の境界面) で構成されます。オルガノイドは、直径 \(1.8\,\hbox {mm}\) の仮想球形状としてシミュレートされました。大気条件は、圧力 \(1\,\hbox {atm}\)、温度 \(37\,^{\circ }\hbox {C}\)、ガス組成 \(5) に設定されました。 \%\) 二酸化炭素、\(17\%\) 酸素、\(78\%\) 窒素。流れの矢印線を使用して、井戸の中央垂直断面上の速度場を視覚化しました。シミュレーションでは合計 519,830 個の四面体要素が使用されました。

ポリアデニル化 RNA 配列データは GSE207894 に寄託されています。図 7A のソースとなる追加の発現差データは、補足表 1 ～ 4 で入手できます。

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この研究は、シュミットフューチャーズ SF 857 と賞番号 1RM1HG011543 (DH、SRS および MT) で国立ヒトゲノム研究所、賞番号 R01MH120295 (SRS) で国立衛生研究所の国立精神衛生研究所によって支援されました。研究プロジェクト庁 (DARPA)、陸軍研究局、協力協定番号 W911NF-18-2-0104、および内務省、賞番号 D20AC00003 に基づく。 (MR および MT)、米国科学財団の賞番号は NSF 2034037 (REG、SRS および MT) および NSF 2134955 (MT、SRS および DH) です。 DH はハワード・ヒューズ医学研究所の研究員です。著者らは、議論してくださったPattawong Pansodtee、David Parks、Matt Elliott、貴重なリソースと支援を提供してくださったIBSC細胞培養施設(RRID:SCR 021353)、およびUCSCライフサイエンス顕微鏡センター(RRID:SCR 021135)に特別な感謝を表したいと思います。。

カリフォルニア大学サンタクルーズ校サンタクルーズゲノミクス研究所、カリフォルニア州サンタクルーズ、95064、米国

スペンサー・T・ザイラー、ゲイリー・L・マンタラス、セバスチャン・トーレス・モントーヤ、ピーター・V・ボードン、ヴィクトリア・T・リー、リアム・トラン、ライアン・N・ホフマン、マルコ・ロランディ、リチャード・E・グリーン、デヴィッド・ハウスラー、ソフィー・R・サラマ＆ミルチャテオドレスク

カリフォルニア大学サンタクルーズ校、生体分子工学部、サンタクルーズ、カリフォルニア州、95064、米国

スペンサー・T・ザイラー、リアム・トラン、リチャード・E・グリーン、デヴィッド・ハウスラー

分子・細胞・発生生物学部、カリフォルニア大学サンタクルーズ校、サンタクルーズ、カリフォルニア州、95064、米国

ゲイリー・L・ブランケット、ライアン・N・ホフマン、ソフィー・R・サラマ

カリフォルニア大学サンタクルーズ校、電気およびコンピュータ工学部、サンタクルーズ、カリフォルニア州、95064、米国

ジョン・セルバーグ、セルジオ・ラム、セバスチャン・トーレス＝モントーヤ、ピーター・V・ボードン、ヴィクトリア・T・リー、フィン・アーメンド、マルコ・ロランディ、ミルチャ・テオドレスク

ハワード・ヒューズ医学研究所、カリフォルニア大学サンタクルーズ、サンタクルーズ、CA、95064、米国

デビッド・ハウスラー

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STS、JS、SC、および FA は、自動化されたマイクロ流体細胞培養プラットフォームを開発しました。 GLM と RNH は細胞培養物を提供しました。 STS と GLM は実験とトランスクリプトーム解析を実施しました。 STM は数値流体力学シミュレーション PVB を開発し、VTL は画像の取得と解析を実行しました。 LTおよびRNHは免疫組織化学的染色を行った。 STS はフィギュアの写真と図面を作成しました。 MR、DH、SRS、REG、MT がチームを監督し、資金を確保しました。著者全員が原稿の執筆に協力しました。

ソフィー・R・サラマまたはミルチャ・テオドレスクへの通信。

STS と GLM は OrganOmics の創設者であり、同封の文書で報告された研究の影響を受ける可能性のある会社です。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Seiler, ST、Mantalas, GL、Selberg, J. 他モジュール式自動マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、大脳皮質オルガノイドの解糖ストレスを軽減します。 Sci Rep 12、20173 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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受信日: 2022 年 7 月 12 日

受理日: 2022 年 9 月 8 日

公開日: 2022 年 11 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20096-9

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